ERA’S JOURNAL OF MEDICAL RESEARCHVOL.2 NO.1
Review Article


  AN INSIGHT TO RNA INTERFERENCE BASED GENE SILENCING




                                     Saliha Rizvi

                                 Syed Tasleem Raza

                                   Farzana Mahdi

                              Department of Biochemistry, 

    Era's Lucknow Medical College and Hospital, Lucknow, Uttar Pradesh India– 226003.


ABSTRACT
The discovery of RNA interference (RNAi) is among the most significant 
                                                                Address for correspondence 
biomedical breakthroughs in recent history. Multiple classes of small 
RNA, including small–interfering RNA (siRNA) and micro–RNA 
                                                                Dr. Syed Tasleem Raza
(miRNA) play important roles in many fundamental biological and 
                                                                        (PhD)
                                                              (Department of Biochemistry) 
disease processes. RNA interference, triggered by double–stranded RNA 
                                                            Era's Lucknow Medical College and 
molecules, was initially recognized as a handy tool to reduce gene 
                                                                      Hospital, 
expression but now it is recognized as a mechanism for cellular protection 
                                                                Lucknow, India–226003.
and cleansing. It defends the genome against molecular parasites such as 
                                                              Ph +91 522 2408122, 2408123 
viruses and transposons, while removing abundant but aberrant 
                                                                Fax: +91 5222407824 
nonfunctional messenger RNAs. Nonetheless, these new pools of 
                                                              Email: tasleem24@gmail.com
knowledge have opened up avenues for unraveling the finer details of the 
small RNA mediated pathways. In this paper, we discuss the molecular 
aspects in biomedical research of RNA interference and its applications. 

Key words: RNA interference, gene silencing, miRNA, siRNA, mRNA targeting.

INTRODUCTION
                                              RNA degradation process called post transcriptional 
The studies on RNA led to the discovery of different 
                                              gene silencing (PTGS/RNAi) (1). This phenomenon 
classes of RNA's like, messenger RNA (mRNA), transfer 
                                              was first observed by Fire and Mello in the year 1998 
RNA (tRNA), ribosomal RNA (rRNA) and small nuclear 
                                              for which they were awarded Nobel Prize in 2006. The 
RNA (snRNA). Each of the different types of RNA are 
                                              central role in this process is mediated by two types of 
encoded by their own specific gene and they having 
                                              small RNA molecules miRNA and siRNA. These 
various important roles in our body such as mRNA 
                                              double stranded molecules trigger suppression of gene 
encodes amino acid sequence of various protein 
                                              activity in a homology–dependent manner. This 
molecules, tRNA helps in bringing different amino acids 
                                              phenomenon is seen in many eukaryotes and is initiated 
to the ribosomes during the process of translation, rRNA 
                                              by an endonuclease DICER. The natural functions of 
along with various ribosomal proteins form ribosomes, 
                                              RNAi have been found to be mainly in cellular defense 
snRNA which are only found in eukaryotes and help in 
                                              against viruses, genomic containment of 
RNA processing. Apart from these, the discovery of an 
                                              retrotransposons, and post–transcriptional regulation of 
independent novel class of RNA molecules (miRNA and 
                                              gene expression. Infact, RNAi is proving to be of 
siRNA) was made which were comparatively small 
                                              immense importance in the present scenario for 
(~19–30 nts), and were initially thought to be the 
                                              treatment of various diseases in plants/animals, drug 
degradation products of larger RNA molecules. It is these 
                                              designing, crop improvement, increasing the quality of 
small RNAs which are now considered to regulate many 
                                              food, pest/weed control and will most likely lead to 
cellular processes in the eukaryotes like replication, 
                                              novel medical applications in the future. 
transcription, translation, chromosome structure, RNA 
            EJMR
editing.  RNA interference (RNAi) is a novel gene 
                                              COMPONENTS OF RNAi MACHINERY
regulatory mechanism that regulates a number of 
                                              Analysis of mutants defective in RNAi revealed a 
processes within living cells. It limits the transcript level 
                                              number of proteins and enzymes essential to this 
by either suppressing transcription, transcriptional gene 
                                              process. Some of the components identified serve as 
silencing (TGS) or by activating a sequence specific 
                                              initiators and others as effectors, amplifiers and 


                                          42                          ERA’S JOURNAL OF MEDICAL RESEARCHJan.–June.2015VOL.2 NO.1


                                              dsRNAs that are finally the targets for sequence–
transmitters of gene silencing process.
                                              specific RNA degradation (15,16).
Dicer
                                              Small interfering RNAs (siRNAs)
The enzyme was first discovered in Drosophila (2). It 
                                              It was in 1999 when Hamilton and Baulcombe reported 
belongs to the RNase III–family, which show specificity 
                                              the presence of 21–25 nt. long dsRNA complimentary 
for dsRNA and cleave them with 3' overhangs of 2 to 3 
                                              to both strands of silenced genes in Arabidopsis 
nucleotides and 5'–phosphate and 3'–hydroxyl termini 
 
                                              undergoing PTGS called siRNA's. They contain two 
(3).They can cleave long dsRNAs and stem–loop 
                                              nucleotide 3'overhangs (17). These RNA were also 
precursors into siRNAs and miRNAs in an ATP–
                                              seen to silence expression in naïve Drosophila S2 cells 
dependent manner, respectively (4). Dicer contains 
                                              and embryo extracts (17,18).
several characteristic domains, a N–terminal helicase 
domain, PAZ domain (found in Piwi/Argonaute/Zwille 
                                              Four types of siRNAs have been identified 
proteins), dual RNase III domains, and a double stranded 
 
                                              depending on the biogenesis of dsRNA precursor 
RNA–binding domain (2).Animals generally encode a 
                                              and its source.
single type of dicer with exceptions of Drosophila and C. 
elegans which encode two dicers (5). Unlike animals, 
                                              ·Trans–acting short interfering RNAs (tasiRNA): 
plants usually encode multiple dicers. In Arabidopsis, 
                                                  They are ~21 nt. long and closely related to 
DCL 2, 3, 4 are involved in the generation of different 
                                                  miRNAs in size and function. They require 
siRNA species while DCL1 solely helps in miRNA 
                                                  endogenous transcript as template,(19,20) and 
synthesis. Each dicer produces siRNAs of characteristic 
                                                RdRP, AGO–7 and DCL–4 for their production 
length, e.g. DCL2, DCL3 and DCL4 generate 22, 24 and 
                                                  from template transcript (21). Organisms which 
21 nt long siRNA species, respectively (6–8).
                                                lack RdRP like humans and flies, are devoid of 
                                                  tasiRNAs. 
RNA–induced silencing complex (RISC) and 
                                                ·Repeat–associated short interfering RNAs 
Argonaute
                                                  (rasiRNAs): These are ~24–26 nts. long and 
RNA interference is initiated in cell's cytoplasm by short 
                                                  require DCL3 and RdRP for their synthesis. They 
double stranded RNA molecules where they interact with 
                                                  function in gametogenesis in flies and in silencing 
RISC located in ribosome .The RISC proteins have been 
 
                                                of viral transcripts.
identified by mass spectrometry as Argonaute 2,(9)VIG, 
Dfxr (10) and TSN. The duplex siRNAs are unwound by 
                                              ·Scan RNAs (scnRNAs): They are much longer, 
helicase activity of Argonaute. Argonaute has three 
                                                ~29 nts. long. It was first discovered in a protozoan 
domais, PAZ (near N–terminal), MID and PIWI (near C–
                                                  Tetrahymena thermophila, where it produced 
terminal) domains (11). Animals and plants encode 
                                                  modified newer versions genome from the existing 
multiple Argonaute homologs like AGO1, AGO2, AGO6 
                                                ones (22).
etc.(12). AGO6 is involved in DNA methylation and 
 
                                              · Long siRNAs (lsiRNAs)– They are ~30–40 nt. long 
transcriptional gene silencing(13) while AGO7 has been 
                                                  and require AGO–7, DCL–1 and DCL–4 for their 
shown to participate in both tasi–RNA and long siRNAs 
                                                  biogenesis. They cause decapping of target 
biogenesis (14).
                                                  transcripts and finally their degradation via. an 
                                                  exonuclease (XRN4).
RNA Helicases
They are a diverse array of proteins specific for each 
                                              The target specificity of siRNA require a “seed region” 
organism seems to carry out aberrant RNA elimination 
                                              which occurs at the 5' end of siRNA encompassing 
surveillance in most eukaryotes. The A. thaliana mutant 
                                                ribonucleotides between 2 to 7 position and confer 
SDE3, defective in production of RNA helicase is unable 
                                              target specificity to siRNA.  The siRNA containing a 
to carry out RNAi process.  The SMG–2 homolog from 
                                              single mismatch with their substrate fail to repress the 
C. elegans have ATPase, RNA binding and helicase 
                                              target mRNA and don't simply shift their regulatory 
activities and contain conserved cysteine–rich region 
                                              mode to translation inhibition.
near the C–terminus.

            EJMR
                                              Micro–RNAs (miRNAs)
RNA–dependent RNA polymerase (RdRP)
                                              The miRNA were discovered in 1993. Lee and 
The major function of this protein is to generate 
                                              colleagues in 2004 elucidated the function of a non–
secondary siRNAs in a primer–dependent and 
                                              coding transcript in C. elegans, whose expression 
independent fashion and in amplifying silencing effect. 
                                              varied spatio–temporally and the mutants showed 
The RdRP enzymes recognize the aberrant RNAs as 
                                              developmental abnormalities (5). MicroRNA genes 
templates and synthesize antisense RNAs to form 


                                          43                    AN INSIGHT TO RNA INTERFERENCE BASED GENE SILENCING 


                                              RISC associated proteins with cap or poly–A tail 
constitute ~1% of the total coding genes and form the 
 
                                              associated proteins (25,37).miRNA–repressed 
largest class of regulatory molecules (23,24). They show 
                                              transcripts in animals are engulfed into dynamic 
high tissue–specific and temporal expression and are 
                                              vesicles called P (Processing)–bodies (GW1 or 
believed to have evolved to take intensive care of 
                                              cytoplasmic bodies) that carry out active mRNA 
developmental pathways that can be achieved by 
                                              degradation via nonsense mediated decay and gene 
translation suppression (occurring mainly in animals) or 
                                              silencing (38,39). Target mRNA, via interaction 
target cleavage (occurring mainly in plants) (25,26). 
                                              between one of the RISC members (AGO1) and the P–
They have been named variously i.e., miRNAs which 
                                              body proteins (GW1 and AIN1) gain entry into these 
mediate spatial development are referred to as sdRNAs, 
                                              structures (40). These bodies act as storage sites for 
while cell cycle miRNAs are referred to as ccRNAs, etc. 
                                                translationally suppressed mRNA that are released 
Their biogenesis is believed to be operative by more than 
                                              when required and can actively translate (41). P–bodies 
one pathway, as described below:
                                              have been shown to be associated with various 
                                              components of translation machinery (except 
1. Canonical miRNA pathway: Micro–RNAs are ~19–
                                              ribosomes) and RNAi components like AGO1, 
23 nucleotide long single–stranded RNAs. Prior to 
                                              GW182, miRNAs and CCR4 (41). These are yet to be 
maturity, they first undergo extensive post–
                                              discovered in plants but some similar nuclear foci 
transcriptional modification. They are expressed from a 
                                              called Cajal bodies have recently been reported from 
much longer RNA–coding primary transcript known as a 
                                              Arabidopsis (42).
pri–miRNA which is processed, in the cell nucleus, to a 
70–nucleotide stem–loop structure called a pre–miRNA 
                                              GENERAL MECHANISM
by the microprocessor complex. This complex consists 
                                              The process of RNA interference can be divided into 
of an RNase III enzyme called Drosha and a dsRNA–
                                              four stages, which are as follows: 
binding protein DGCR8. The dsRNA portion of this pre–
miRNA is bound and cleaved by Dicer to produce the 
                                              1. Double stranded RNA cleavageThe first step 
mature miRNA molecule that can be integrated into the 
                                              includes ATP–dependent, processive dsRNA cleavage 
RISC complex. Maturation of miRNA begins in the 
                                              into double–stranded fragments 21 to 25 nucleotides 
nucleus and terminates in the cytoplasm. 
                                              long containing 5' phosphate and 3' hydroxyl termini, 
                                              and two additional overhanging nucleotides on their 
3.6.2 Mirtrons:Animals have been shown to follow yet 
                                              3'ends (17,43). The length of the cleaved RNA 
another mode of miRNA biogenesis where intron 
                                              maximizes target–gene specificity and minimizes non–
sequences can produce miRNAs. These miRNAs 
                                              specific effects. Exogenous dsRNA is detected and 
originating from introns were termed mirtrons (27,28). 
                                              bound by an effector protein, known as RDE–4 in C. 
Fourteen mirtrons from Drosophila and four mirtrons 
                                              elegans and R2D2 in Drosophila that stimulates dicer 
from C. elegans have been identified so far. Mirtrons 
                                              activity. In C. elegans, this initiation response is 
have not yet been identified in plants and other 
                                              amplified through the synthesis of a population of 
organisms.
                                              'secondary' siRNAs by an RNA–dependent RNA 
The miRNAs are thought to direct RISC–related 
                                              polymerase (RdRP) during which the dicer–produced 
complexes to their targets on the basis of sequence 
                                              initiating or 'primary' siRNAs are used as templates 
complimentarity. In contrast to this, most animal 
                                              (Fig.1)
miRNAs appear to recognize their targets by imperfect 
pairing. For example, the interaction between let–7 and 
                                              2. Activation of silencing complex: In the second step 
its target lin–14 involves multiple binding sites, each of 
                                              siRNAs are incorporated into RISC (RNA–induced 
which pairs imperfectly with the small RNA. This 
                                              silencing complex) which undergoes activation in the 
problem doesnot exist in plants where almost all 
                                              presence of ATP so that the antisense component of the 
miRNAs are extensively complimentary to their 
                                              unwound siRNA becomes exposed and allows the 
targets,(29,30) and act as siRNAs to direct 
                                              RISC to perform the downstream RNAi reaction. This 
endonucleolytic cleavage of target mRNAs (29,31,32). 
                                              siRNA duplex containing ribonucleoprotein complex 
                                              is called siRNP (44). This formation requires ATP 
Animal miRNA, as a general rule, binds to the 3′ UTR 
            EJMR
                                              which reflects energy need for unwinding step and 
region of the target,(33,34) while in caseof  plants, 
                                              other conformational requirements. Members of 
binding occurs in the coding region (35). The seed region 
                                              Argonaute family probably help in stabilization of 
determines the target sequence and helps in miRNA 
                                              siRNA, RISC formation and mRNA targeting. siRNA, 
editing (36). In animals, studies suggest that miRNA 
                                              RISC formation and mRNA targeting.
binding promotes either deadenylation or decapping of 
                                              3. Unwinding of the siRNA duplex: The third step 
the target which is probably achieved by interaction of 


                                          44                          ERA’S JOURNAL OF MEDICAL RESEARCHJan.–June.2015VOL.2 NO.1


                                              generalized response to pathogens that downregulates 
involves unwinding of the siRNA duplex and 
                                              any metabolic processes in the host that aid the 
remodelling of the complex to create an active form of 
                                              infection process. In both juvenile and adult 
RISC. Only one of the two strands, which is known as the 
                                              Drosophila, RNA interference is important in antiviral 
guide strand, binds the argonaute protein and directs gene 
                                              innate immunity and is active against pathogens such as 
silencing. The other anti–guide strand or passenger strand 
                                              Drosophila X virus. A similar role in immunity may 
is degraded. This process is ATP–independent and 
                                              operate in C. elegans, as argonaute proteins are 
performed directly by the protein components of RISC. 
                                              upregulated in response to viruses and worms that over 
The strand selected as the guide tends to be the one whose 
                                              express components of the RNAi pathway are resistant 
5' end is less stably paired to its complement. The R2D2 
                                            to viral infection.
protein may serve as the differentiating factor by binding 
the more–stable 5' end of the passenger strand. The 
                                              Down and up–regulation of genes
phosphorylated 5' end of the RNA strand enters a 
                                              Endogenously expressed miRNAs, including both 
conserved basic surface pocket and makes contacts 
                                              intronic and intergenic miRNAs, are most important in 
through a divalent cation and by aromatic stacking 
 
                                              translational repression.The roles of endogenously 
between the 5' nucleotide in the siRNA and a conserved 
                                              expressed miRNA in downregulating gene expression 
tyrosine residue.
                                              were first described in C. elegans in 1993. In plants, the 
                                              majority of genes regulated by miRNAs are 
4. Cleavage of mRNA: The final step includes the 
                                              transcription factors thus miRNA activity is 
recognition and cleavage of mRNA complementary to 
                                              particularly wide–ranging and regulates entire gene 
the siRNA strand present in RISC (guide strand of 
                                              networks during development by modulating the 
siRNA),(44,45) by exoribonucleases. In some organisms 
                                              expression of key regulatory genes, including 
(C. elegansArabidopsis thaliana) an additional step in 
                                              transcription factors as well as F–box proteins. RNA 
the RNAi pathway has been described involving a 
                                              sequences (siRNA and miRNA) that are 
population of secondary siRNAs derived from the action 
                                              complementary to parts of a promoter can increase 
of a cellular RNA–dependent RNA polymerase (RdRp). 
                                              gene transcription, a phenomenon dubbed RNA 
Eukaryotic cells possess two major means for regulating 
                                              activation. Here, dicer and argonaute play major role, 
the turnover of mRNAs. In one pathway they utilize the 
                                              possibly via histone demethylation. They have also 
3'–5' exonuclease, exosome, to degrade the message in 
                                              been proposed to upregulate their target genes upon cell 
the cytoplasm (46). The other pathway is thought to 
                                              cycle arrest.
occur in specialized centers known as processing (P) 
bodies/cytoplasmic bodies/mRNA decay centers 
                                              Development 
(38,39). These centers contain  decapping enzymes Dcp1 
                                              Mutations in dcr–1 and ego–1 lead to complete 
and 2 and the 5'–3' exonucleases Xrn1(39). It is thought 
                                              sterility,(50,52) indicating importance of RNAi in 
that transcripts are transported to these centers to be 
                                              germline development. In plants also RNAi–like 
degraded by the 5'–3' exonuclease, Xrn1. Ago2 was 
                                              processes have a crucial role in development (53,54). It 
found to be localized to the cytoplasm, with most of the 
                                            is seen to be involved in maturation of endogenously 
Ago2 concentrated in discrete cytoplasmic bodies, the 
                                              encoded miRNAs,(51,55) some of which are involved 
mammalian equivalent of yeast P–bodies (25,40). 
                                            in development, but most of which have no known 
                                              function at present.                                                                                                                                                                                                                                                                                                
FUNCTIONAL ASPECTS AND APPLICATIONS 
OF RNAi
                                              Gene function analysis
Defence
                                              Double–stranded RNA is artificially synthesized, 
RNA interference acts as a defense mechanism against 
viruses and other foreign genetic material, especially in 
                                              complementary to a gene of interest and introduced into 
plants. It may also prevent the self–propagation of 
                                            a cell where it is recognized as exogenous genetic 
transposons. Apart from plants there is significant debate 
                                              material and activates the RNAi pathway. Using this 
over the ability of siRNAs and longer dsRNAs to induce 
                                              mechanism, researchers can cause a drastic decrease in 
innate immune response (47,48). In mammalian cells 
                                              the expression of a targeted gene which can show the 
molecules less than 30 bp in length are generally believed 
            EJMR
                                              physiological role of the gene product. Functional 
to avoid induction of interferon pathways (47–49). Long 
                                              analysis of almost all the ~19,000 genes of C. elegans 
(27–29 bp) dsRNAs and shRNAs provide more efficient 
gene silencing than shorter, Dicer–independent 
                                              has been carried out with the siRNA–directed 
substrates (48,49). Some plant genomes also express 
                                              knockdown approach (56).
endogenous siRNAs in response to infection by specific 
types of bacteria. These effects may be part of a 


                                          45                  AN INSIGHT TO RNA INTERFERENCE BASED GENE SILENCING 


                                              RNA INTERFERENCE AS A THERAPEUTIC 
To determine gene function
                                              TOOL 
                                            In Animals 
·RNAi is sequence–specific and thus can be 
                                              RNAi is having a lot of applications in biomedical 
targeted, requiring only a few transformants per 
target gene.
                                              research and health care and has begun to produce a 
                                              paradigm shift in the process of drug discovery (60). 
·RNAi is dominant, so phenotypes can be 
                                              Presently, many dsRNA molecules are being designed 
observed in the T1 generation.
                                              for silencing specific genes in humans and animals as 
                                              shown in Table 1. It may be possible to exploit RNA 
·RNAi often leads to partial knockdown and thus 
                                              interference in therapy. Although it is difficult to 
to a range of phenotypes of differing severity; 
                                              introduce long dsRNA strands into mammalian cells 
this facilitates the study of essential genes whose 
                                              due to the interferon response, the use of ds RNAs 
inactivation would lead to lethality or extremely 
                                              shorter than ~30 nts are proving to be successful. The 
severe pleiotropic phenotypes. 
                                              very first application of RNAi were mainly in the 
                                              treatment of macular degeneration and respiratory 
·RNAi can be controlled in a tissue–specific or 
                                              syncytial virus knockdown of host receptors and 
time–dependent manner RNAi can be quickly 
 
                                              coreceptors for HIV,the silencing of hepatitis A and 
and easily used in a wide range of genotypes or 
                                              hepatitis B genes, silencing of influenza gene 
even species, whereas insertion mutant 
                                              expression, and inhibition of measles viral replication. 
collections are limited to just a few due to the 
                                              Potential treatments for neurodegenerative diseases 
effort involved. 
                                              have also been proposed, with particular attention 
·RNAi can be used to reduce the expression of 
                                              being paid to the polyglutamine diseases such as 
several related genes in parallel by targeting 
                                              Huntington's disease. Despite the proliferation of 
conserved regions of the genes, facilitating the 
                                              promising cell culture studies for RNAi–based drugs, 
study of redundant gene functions.
                                              some concern has been raised regarding the safety of 
                                              RNA interference, especially the potential for "off–
Heterochromatin formation 
                                              target" effects in which a gene with a coincidentally 
There is derepression of the centromeric outer–
                                              similar sequence to the targeted gene is also repressed. 
transposon repeats in RNAi mutants deficient for RNAi 
                                            A computational genomics study estimated that the 
components. This led to the proposal that small RNAs 
                                              error rate of off–target interactions is about 10%.
function as guides to target the chromatin modifications 
that are typical of heterochromatin (57). There is reduced 
                                            In Plants
amounts of H3K9 methylation and repeat–associated 
                                              This RNAi technology has proven to be an eco–friendly 
Swi6 in the RNAi mutants. Second evidence was that a 
                                              technique for crop improvement. Through this 
transgene that is located in the centromeric repeats, 
                                              technique the genes which are responsible for inducing 
which would usually be silenced, was activated in RNAi 
                                              various stresses in plants are silenced and novel traits 
mutants. Apart from centromeric heterochromatin 
                                              like disease resistance are incorporated into plants. It 
formation, RNAi pathway is also implicated in the 
                                              has emerged as a method of choice for gene targeting in 
 
targeting of non–centromeric, interstitial sites in 
                                              fungi,(61) viruses,(62,63) bacteria(64) and plants (65). 
euchromatin for silencing. In D. melanogaster, dispersed 
                                            It has been used for applications in biotechnology, 
transgenes that are inserted at several sites in 
                                              particularly in the engineering of food plants that 
euchromatin are silenced at the transcriptional level 
                                              produce lower levels of natural plant toxins as shown in 
through association with the POLYCOMB 
                                              Table 2. Other plant traits that have been engineered in 
 
COMPLEX(58)through histone modifications which is 
                                              the laboratory include the production of non–narcotic 
dependent on components of RNAi pathway. The 
                                              natural products by the opium poppy, resistance to 
Polycomb–dependent silencing involves histone 
                                              common plant viruses, and fortification of plants such 
modifications and is known to keep the chromatin in the 
                                            as tomatoes with dietary antioxidants. 
            EJMR
closed or compact conformation.Heterochromatin  
formation requires that histone H3 of the chromatin is 
first deacetylated and then methylated at lysine 9. This 
                                                DISADVANTAGES OF RNA INTERFERENCE
methylated lysine is subsequently bound by a 
                                              Off–target effect
heterochromatin binding protein, HP1 in highly specific 
                                            In large–scale screens in animals it was observed that 
manner and with a very high affinity (59).
                                              the silencing effects were also seen in genes that were 


                                          46                          ERA’S JOURNAL OF MEDICAL RESEARCHJan.–June.2015VOL.2 NO.1


                                              silencing vectors that are able to operate in a temporally 
not the predicted targets of RNAi. The major difficulty is 
                                              and spatially controlled manner. In coming years better 
the limited sequence specificity of siRNAs, as few as 
                                              and comprehensive understanding of RNAi would 
seven nucleotides of sequence complementarity between 
                                              allow the researchers to work effectively and efficiently 
a siRNA and an mRNA can lead to the inhibition of 
                                            in order to work more on improvement of crop plants 
expression.
                                              nutritionally and in managing various diseases of crop 
A second specificity problem can occur via 'transitive 
                                              plants. Finally, the discovery of RNAi has not only 
silencing', whereby RNAi against a gene–specific 
                                              provided us with a powerful new experimental tool to 
sequence 'spreads' into neighbouring sequences 
                                              study the function of genes but also raises expectations 
conserved between the target mRNA and mRNAs from 
                                              about future applications of RNAi in medicine. 
related genes, which become silenced in turn. 


Inefficacy and instability 
                                              CONFLICT OF INTEREST
RNAi inhibition can have widely varying effects 
                                              The authors declare that they have no competing 
depending on the target gene, the region of the transcript 
                                              interests.
that is targeted and even between sibling plants carrying 
identical RNAi constructs. The instability can result 
                                              REFERENCES 
from silencing of the transgene long hairpin transgenes 
 
appear to be particularly sensitive to transcriptional 
                                            1. Agrawal N, Dasaradhi PVN, Mohmmed A, 
silencing leading to a loss of RNAi phenotypes over 
                                                    Malhotra P, Bhatnagar RK, Mukherjee SK. 
several generations. 
                                                    RNA Interference: Biology, Mechanism, and 
                                                    Applications. Microbiology and Molecular 
Conclusion and Future Prospects
                                                    Biology Reviews. 2003; 67” 657–685.
RNA interference is an area of intense, upfront basic 
research and holds the key to various technological 
                                            2. Bernstein E., Caudy AA., Hammond SM., and 
applications in future due to their higher silencing 
                                                    Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in 
efficiency and shorter time requirements for screening 
                                                    the initiation step of RNA interference. Nature. 
and to analyses functions of wide variety of genes in 
                                                    2001409” 363–366.
different organisms. The RNA silencing technology 
apart from being highly sequence specific is also 
                                            3. Zamore PD. RNA Interference: big applause for 
technologically facile and economical. Therefore, this 
                                                    silencing in Stockholm. Cell. 2006: 127” 
technique has great potential in agriculture specifically 
                                                    1083–1086.
for nutritional improvement of plants and the 
management of various plant diseases. Future directions 
                                            4. Tan FL. and Yin JQ. Application of RNAi to 
will focus on developing finely tuned RNAi–based gene 
                                                    cancer research and therapy. Front. Biosci. 

Table1. Application of RNAi in treating human disease (66)

    DiseaseCase study
  

Lymphoblastic leukemia Using siRNA’s specific for the BCR–ABL transcript to silence 
                                the oncogenes 

Bladder cancer Treatment by miRNA’s as biomarkers 

HIV Downregulation of cellular cofactors required for HIV infection 

                                by RNAi 

Viral hepatitis Inhibition of Fas expression by siRNA 

Ocular diseases Shutting down production of VEGF by siRNA 

                                                                                therapeutic  
Metabolic disease and 
                                Treatment of these diseases by miRNA’s as potencial
            EJMR
neurodegenerative disorders targets. 

Cardiovascular and cerebro Used to reduce damage to heart tissues and brain cells 

vascular diseases 

 
Pancreatic and colon Use of retroviral vectors to introduce interfering RNAs specific 

carcinomasfor an oncogenic variant of K–Ras
 

                                          47                  AN INSIGHT TO RNA INTERFERENCE BASED GENE SILENCING 


 
Table 2. Application of RNAi in plants (67)

Application Case study 

Increasing the level of lysine Reduction of lysine catabolism and improving seed germination   
 generating a dominant high–lysine maize variant by knocking out the expression 
 of the 22–kD maize zein storage protein

Barley and Rice Resistance of barley to BYDV and producing a rice variety called  
  LGC–1 (low glutenin content 1) 

Banana Production of banana varieties resistant to the Banana Bract Mosaic Virus 
  (BBrMV) 

Cotton Transgenic cotton plants expressing a RNAi construct of the d–cadinene  
 synthase gene of gossypol synthesis fused to a seed–specific promoter caused 
 seed–specific reduction of Gossypol

Wood and fruit quality –Down regulation of lignin biosynthesis pathways.
 –Producing transgenic hypoallergenic apples and a possible solution for the 
 undesirable separation of juice into clear serum and particulate phase  

Coffee RNAi technology has enabled the creation of varieties of Coffee that produces 
 natural coffee with low or very low caffeine content

Healthier oil Using RNAi to silence the gene in cotton which codes for the enzyme that 
  converts oleic acid into a different fatty acid


Tomato RNAi–mediated suppression of DET1 expression under fruit–specific promoters
 has recently shown to improve carotenoid and flavonoid levels in tomato fruits 
 with minimal effects on plant growth

Gentian Producing white–flowered transgenic gentians by suppressing the chalcone 
  synthase (CHS) gene .

Blue Rose Producing blue transgenic rose by knock downing the cyanidin genes in rose and 
 carnation .

Pest control Combining Bt technology with RNAi would both enhance product performance 
 and further guard against the development of resistance to Bt proteins


Fig1. Schematic representation of four–step gene silencing pathway (68) 

                                            3`5`
                                            5`
  3`
                      ATP
                                        dsRNA
1st step, generation
                      ADP + Pi, DICER
of siRNAs
              5`p
                              OH3`
          3`HO
                          p5
                              21–25nt siRNAs
2nd step 
                          Rnase(?)
RISC formation
              5`p
                              OH3
                          p5
          3`HO
                              Argonaute family member
          helicase (?)
                      ATP
3rd step 
                      ADP + Pi
siRNA unwinding
active RISC* formation
                            OH3
                                  RISC*
          5`p
            EJMR

                                                  additional step in plants, fungi
                                                and C. elegans including the generation
4th step, recognition
                                                of secondary siRNAs by RdRp activity
and mRNA cleavage
                                                        3`HO
                                                                            p5`
          3`HO
                              p5
                                                                                          3`5`
  5`
                                            3`
                                                                                    mRNA
                                                                dsRNA formation
                                      mRNA
                                                                                          3`5`
                                                                                          5`
                                                3`
                cleavage site

                                        48                            ERA’S JOURNAL OF MEDICAL RESEARCHJan.–June.2015VOL.2 NO.1


2005: 10” 1946–1960.
                                              16. Cogoni, C., and G. Macino. Gene silencing in 
                                                    Neurospora crassarequires a protein 
5. Lee YS, Nakahara K, Pham JW, Kim K, He Z, 
                                                    homologous to RNA–dependent RNA 
Sontheimer EJ, Carthew RW,  Distinct roles for 
                                                    polymerase. Nature. 1999: 399” 166–169.
Drosophila Dicer–1 and Dicer–2 in the 
siRNA/miRNA silencing. Cell. 2004: 117(1)” 69–
                                              17. Elbashir S. M., Lendeckel W., and Tuschl T.  
81.
                                                    RNA interference is mediated by 21– and 22–
                                                    nucleotide RNAs. Genes Dev. 2001: 15” 188
6. Deleris A, et al. Hierarchical action and inhibition 
                                                    200.
of plant Dicer–like proteins in antiviral defense. 
Science. 2006: 313” 68–71.
                                              18. Yang D., Lu H., and Erichson J. W.  Evidence 
                                                    that processed small dsRNA may mediate 
7. Blevins T, Rajeswaran R, Shivaprasad PV, et al. 
                                                    sequence specific mRNA degradation during 
Four plant Dicers mediate viral small RNA 
                                                    RNAi in Drosophila embryos. Curr. Biol. 2000: 
biogenesis and DNA virus induced silencing. 
                                                    10” 1191–1200.
Nucleic Acids Res. 2006: 34(21)” 6233–46.

                                              19. Talmor–Neiman M, Stay R, Klipcan L, Kobi B, 
8. Xie Z, Allen E, Wilken A, Carrington JC. Dicer–
                                                      Baulcombe DC, Arazi T. Identification of trans–
like 4 functions in trans–acting small interfering 
                                                    acting siRNAs in moss and an RNA–dependent 
RNA biogenesis and vegetative phase change in 
                                                    RNA polymerase required for their biogenesis. 
Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad Sci USA. 
                                                    Plant J. 2006: 48(4)” 511–21.
2005: 102(36)” 12984 – 9.

                                              20. Fahlgren N, Montogomery TA, Howell MD, et 
9. Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, 
                                                    al. Regulation of AUXIN RESPONSE 
Kobayashi R, Hannon GJ. Argonaute2, a link 
                                                    FACTOR3 by TAS3 ta–siRNA affects 
between genetic and biochemical analyses of 
                                                      developmental timing and patterning in 
RNAi. Science. 2001: 293” 1146–1150.
                                                      Arabidopsis. Curr Biol. 2006: 16(9)” 939–44.
10. Caudy AA., Myers M., Hannon GJ. and 
                                              21. Montgomery TA, Howell MD, Cuperus JT. 
Hammond SM. Fragile X–related protein and 
                                                    Specificity of ARGONAUTE7–miR390 
VIG associate with RNA interference machinery. 
                                                    interaction and dual functionality in TAS3 
Genes Dev. 2002: 16” 2491–2496.
                                                    trans–acting siRNA formation. Cell. 2008: 
                                                    133(1)” 128–41
11. Cerutti L, Mian N, Bateman A. Domains in gene 
silencing and cell differentiation proteins: the 
                                              22. Liu J, Carmell MA, Rivas FV, Marsden CG, 
novel PAZ domain and redefinition of the Piwi 
                                                    Thomson JM, et al. Argonaute2 is the catalytic 
domain. Trends Biochem. Sci.2000: 25” 481–82
                                                    engine of mammalian RNAi. Science. 2004: 
                                                      305”1437–41.
12. Okamura K, Ischizuka A, Siomi H, Siomi MC. 
Distinct roles for Argonaute proteins in small 
RNA– directed RNA cleavage pathways. Genes 
                                              23. Grad Y, Aach J, Hayes GD, Reinhart GD, 
Dev. 2004: 18(14)” 1655–66.
                                                    Church GM, Ruvkun G, et al. Computational 
                                                    and experimental identification of C. elegans 
13. Zheng X, Zhu J, Kapoor A, Zhu JK. Role of 
                                                      microRNAs. Mol Cell. 2003: 11(5)” 1253–63.
Arabidopsis AGO6 insiRNA accumulation, DNA 
methylation and transcriptional gene silencing. 
                                              24. Bartel DP. MicroRNAs: genomics, biogenesis, 
EMBO J. 2007: 26(6)” 1691–701.
                                                      mechanism, and function. Cell. 2004:  116(2)” 
                                                    281–97
14. Katiyar–Agarwal S, Gao S, Vivian–Smith A, Jin 
            EJMR
H. A novel class f bacteria–induced small RNAs in 
                                              25. Pillai, RS, Bhattacharyya SN, Artus CG, Zoller 
Arabidopsis. Genes Dev. 2007: 21(23)” 3123–34.
                                                    T, Cougot N, Basyuk E, et al. Inhibition of 
                                                      translational initiation by let–7 MicroRNA in 
15. Cogoni C. and Macino G.  Conservation of 
                                                    human cells. Science 2005: 309” 1573–1576.
transgene–induced post–transcriptional gene 
silencing in plants and fungi. Trends Plant Sci. 
                                              26. Aukerman, M.J. and Sakai, H. Regulation of 
1997: 2” 438–443.

                                          49                    AN INSIGHT TO RNA INTERFERENCE BASED GENE SILENCING 


                                                    21(15)” 1857–62.
flowering time and floral organ identity by a 
microRNA and its APETALA2–like target genes. 
                                              38. Sheth U, and Parker R. Decapping and decay of 
Plant Cell. 2003: 15” 2730–2741
                                                    messenger RNA occur in cytoplasmic 
                                                    processing bodies. Science. 2003: 300” 
27. Okamura K, Hagen JW, Duan H, Tyler DM, Lai 
                                                    805–808.
EC. The mirtron pathway generates microRNA–
class regulatory RNAs in Drosophila. Cell. 2007: 
                                              39. Cougot N, Babajko S, Seraphin B. Cytoplasmic 
130(1)” 89–100
                                                    foci are sites of mRNA decay in human cells. J 
                                                    Cell Biol. 2004: 165(1)” 31–40.
28. Ruby JG, Jan CH, Bartel DP. Intronic microRNA 
precursors that bypass Drosha processing. 
                                              40. Liu J, Valencia–Sanchez MA, Hannon GJ, 
Nature. 2007: 448(7149)” 83–6.
                                                    Parker R. MicroRNA–dependent localization of 
                                                    targeted mRNAs to mammalian P–bodies. Nat 
29. Llave C, Xie Z, Kasschau KD and Carrington JC.  
                                                    Cell Biol. 2005: 7(7)” 719–23.
Cleavage of Scarecrow–like mRNA targets 
directed by a class of Arabidopsis miRNA. 
                                              41. Bhattacharyya SN, Habermacher R, Martine U, 
Science. 2002: 297” 2053–2056.
                                                    Closs EI, Filipowicz W. Relief of microRNA 
                                                    mediated translational repression in human 
30. Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burge CB, 
                                                    cells subjected to stress. Cell 2006: 125(6)” 
Bartel B et al. Prediction of plant microRNA 
                                                    1111–24.
targets. Cell. 2002: 110(4)” 513–20.

                                              42. Song L, Han MH, Lesicka J, Fedoroff N. 
31. Kasschau K, Xie Z, Allen E, Llave C, Chapman E, 
                                                    Arabidopsis primary microRNA processing 
Krizan K et al. P1/HC–Pro, a viral suppressor of 
                                                    proteins HYL1 and DCL1 define a nuclear body 
RNA silencing, interferes with Arabidopsis 
                                                    distinct from the cajal body. Proc Natl Acad Sci 
development and miRNA function. Dev. Cell. 
                                                    USA. 2007: 104(13)” 5437–42.
2003: 4” 205–217.

                                              43. Hamilton AJ, Baulcoumbe DC. A species of 
32. Tang G, Galili G. Using RNAi to improve plant 
                                                    small antisense RNA in posttranscriptional gene 
nutritional value: from mechanism to application. 
                                                    silencing in plants. Science. 1999: 286(5441)” 
TRENDS in Biotechnology. 2003: 22(9)” 463–
                                                    950–952.
469.

                                              44. Nykanen A, Haley B, Zamore PD. ATP 
33. Lewis B, Burge C, Bartel D. Conserved seed 
                                                    requirements and small interfering RNA 
pairing, often flanked by adenosines, indicates 
                                                    structure in the RNA interference pathway. Cell 
that thousands of human genes are microRNA 
                                                    2001: 107” 309–21.
targets. Cell. 2005: 120(1)” 15–20.

                                              45. Hutvagner G, Zamore PD. RNAi: nature abhors 
34. Brennecke J, Stark A, Russell RB, Cohen SM. 
                                                    a double–strand. Curr Opin Genet Dev. 2002: 
Principles of microRNA– target recognition. 
                                                    12” 225–32.
PLoS Biol. 2005: 3(3)” 85.

                                              46. Anderson J. S. and Parker R. P. The 3´ to 5´ 
35. Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhodes MW, Bartel 
                                                    degradation of yeast mRNAs is a general 
B and Bartel DP. MicroRNAs in plants.Genes 
                                                    mechanism for mRNA turnover that requires 
Dev. 2002: 16” 1616–1626.
                                                    the SKI2 DEVH box protein and 3´to 5´ 
                                                    exonucleases of the exosome complex. EMBO 
36. Blow MJ, Grocock RJ, van Dongen S. RNA 
                                                    J. 1998: 17” 1497–1506
editing of human microRNAs. Genome Biol. 
            EJMR
2006: 7(4)” R27.
                                              47. Manche L, Green SR, Schmedt C. and Mathews 
                                                    MB. Interactions between double–stranded 
37. Wakiyama M, Takimoto K, Ohara O, Yokoyama 
                                                    RNA regulators and the protein kinase DAI. 
S. Let–7 microRNA– mediated mRNA 
                                                    Mol. Cell. Biol. 1992: 12” 5238–5248.
deadenylation and translational repression in a 
mammalian cell–free system. Genes & Dev. 2007: 
                                              48. Kim DH, Behlke MA, Rose SD, Chang MS, 


                                          50                            ERA’S JOURNAL OF MEDICAL RESEARCHJan.–June.2015VOL.2 NO.1


                                              58. Fire A.  RNA triggered gene silencing. Trends 
Choi S. and Rossi JJ. Synthetic dsRNA Dicer 
substrates enhance RNAi potency and efficacy. 
                                                    Genet. 1999: 15” 358–363.
Nat. Biotechnol. 2004: 23” 222–226.
                                              59. Bannister AJ, Zegerman P, Partridge JF, Miska 
49. Siolas D, Lerner C, Burchard J, Ge W, Linsley PS, 
                                                    EA et al.  Selective recognition of methylated 
Paddison PJ. Synthetic shRNAs as potent RNAi 
                                                    lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo 
triggers. Nat. Biotechnol. 2004: 23” 227–231.
                                                    domain. Nature. 2001; 410” 120–124.

50. Smardon A, Spoerke JM, Stacey SC, Klein N, 
                                              60. Hannon GJ and Rose JJ. Unlocking the potential 
Mackin ME, and, Maine EM.  EGO–1 is related to 
                                                    of the human genome with RNA interference. 
RNA–directed RNA polymerase and functions in 
                                                    Nature 2004; 431” 371–378.
germ–line development and RNA interference in 
C. elegans. Curr. Biol. 2000: 10” 169–178.
                                              61. Nakayashiki. RNA Silencing in Fungi: 
                                                    Mechanisms and Applications. Federation of 
51. Ketting RF, Fischer SE, Bernstein E, Sijen T, 
                                                    European Biochemical Societies Letters. 2005; 
Hannon GJ, and Plasterk RHA.  Dicer functions 
                                                    579” 5950–5970.
in RNA interference and in synthesis of small RNA 
involved in developmental timing in C. 
                                              62. Baulcombe DC. RNA silencing in Plants. 
elegans.Genes Dev. 2001: 15” 2654–2659
                                                    Nature. 2004. 431” 356–363.

52. Knight SW, Bass BL. A role for the RNase III 
                                              63. Wani SH. and Sanghera GS. Genetic 
enzyme DCR–1 in RNA interference and germ 
                                                    Engineering for Viral Disease Management in 
line development in Caenorhabditis elegans. 
                                                    Plants. Notulae Scientia Biologicae. 2010; 2” 
Science   293” 2269–71.2001:
                                                    20–28.

53. Bohmert K, Camus I, Bellini C, Bouchez D, 
                                              64. Escobar MA, Civerolo EL, Summerfelt KR. and 
Caboche M, and Benning C.  AGO 1 defines a 
                                                    Dandekar AM. RNAi–Mediated Oncogene 
novel class of Arabidopsis controlling leaf 
                                                    Silencing Confers Ressitance to Crown Gall 
development. EMBO J. 1998: 17” 170–180.
                                                    Tumorigenesis. Proceedings of the National 
                                                    Academy of Sciences USA. 2001; 68(23)” 
54. Jacobsen SE, Running MP and Meyerowitz EM. 
                                                    13437–42.
Disruption of an RNA helicase/RNAseIII gene in 
Arabidopsis causes unregulated cell division in 
                                              65. Brodersen P and Voinnet O. The Diversity of 
floral meristems. Development 1999: 126” 5231–
                                                    RNA Silencing Pathways in Plants.  Trends in 
5243.
                                                    Genetics 2006; 22” 268–280.

55. Grishok A, Pasquinelli AE, Conte D et al.  Genes 
                                              66. Angaji SA, Hedayati SS, Poor RH et al. 
and mechanisms related to RNA interference 
                                                    Application of RNA interference in treating 
regulate expression of the small temporal RNAs 
                                                    human diseases. J. Genet. 2010; 89” xx–xx
that control C. elegans developmental timing. 
Cell. 2001: 106” 23–34.
                                              67. Angaji SA, Hedayati SS, Poor RH. et al. 
                                                    Application of RNA interference in plants. POJ 
56. Dykxhoorn DM, Novina CD, and Sharp PA.  
                                                    2010; 3(3)” 77–84.
Killing the messenger: short RNAs that silence 
gene expression. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003: 
                                              68. Zofia Szweykowska–Kuliñska, Artur 
4” 457–467.
                                                    Jarmolowski and Marek Figlerowicz. RNA 
                                                    interference and its role in the regulation of 
57. Volpe TA. Regulation of heterochromatic 
                                                    eucaryotic gene expression. Acta Biochimica 
silencing and histone H3 lysine–9 methylation by 
            EJMR
                                                    Polonica. 2003; 50(1/2003)” 217–229
RNAi. Science 2002: 297” 1833–1837.






                                          51